1.4 實驗藥品及試劑

碳酸氫鈉、连翘离体氯化鉀、叶乙硫酸鎂、醇提葡萄糖、取物其对磷酸二氫鈉、抗小空肠氯化鈉、鼠蓖收缩氯化鈣、麻油氯化鐵、性腹泻活性及响研氯化鋁、家兔肌自究醋酸鉀[成都市科隆化學品有限公司]，平滑氯乙酰膽堿[成都華夏化學試劑有限公司（中國成都）]，发性蓖麻油（河南省華龍藥業有限公司），连翘离体維拉帕米[Medchemexpress有限公司（美國）]，叶乙洛呱丁胺[西格瑪化學公司（美國聖路易斯）]，醇提色譜乙腈（成都市科隆化學品有限公司），取物其对純化水（杭州娃哈哈集團有限公司），鹽酸[成都市科隆化學品有限公司]、氯化鐵、甲醇（重慶騰華化工有限公司）、醋酸鉀和氯化鋁用於粗提物的植物化學分析。蒸餾水（四川優普超純科技有限公司）用於製備標準溶液、稀釋液和生理鹽溶液（Tyrode溶液）。

1.5儀器

家兔類通用實驗器械，HW-400E恒溫平滑肌槽（四川成都泰盟公司），BL-420F生物機能實驗係統（四川成都泰盟公司），FT-100生物張力傳感器（四川成都泰盟軟件有限公司），優普純水/超純水製造係統（四川優普超純科技有限公司），HH600-2B三用恒溫水浴箱（金壇市科析儀器有限公司），電熱恒溫鼓風幹燥箱（YDYQ,101-2A），粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司，FW177），電子分析天平（Mettle AE 240），旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠，RE-52AA），真空減壓幹燥箱（武漢奧普森試驗設備有限公司，ZK 6050B）。

1.6 實驗動物

選取110隻健康昆明雌雄小鼠（18～22 g）以及42隻健康家兔（2.0～2.5 kg），由川北醫學院動物中心提供[許可證編號：SYXK(chuan)2013-076]，小鼠和家兔飼養於23～26℃、濕度適宜的實驗室環境，12 h光照黑暗循環，期間可自由進食和飲水。本實驗符合中國動物保護委員會的管理，並遵循動物倫理和實驗準則。

1.7 實驗方法

1.7.1 FS ext的急性毒性

取60隻禁食4 h（可自由飲水）的小鼠隨機分為0.5 g/kg FS ext試驗組、1.0 g/kg FS ext試驗組、2.0 g/kg FS ext試驗組、4.0 g/kg FS ext試驗組、8.0 g/kg FS ext試驗組、16.0 g/kg FS ext試驗組，每組10隻，分別給予0.5 g/kg、1.0 g/kg、2.0 g/kg、4.0 g/kg、8.0g/kg、16.0 g/kg的FS ext進行灌胃，處理後的小鼠可自由飲水進食，記錄14 d內小鼠的死亡情況和毒性跡象，建立相應的劑量-效應曲線，從而確定FS ext的半數致死劑量（LD50），以確定其安全性[9]。

1.7.2 對蓖麻油性腹瀉的影響

另取50隻小鼠隨機分成陰性組、陽性組、0.25 g/kg FS ext試驗組、0.50 g/kg FS ext試驗組、1.00 g/kg FS ext試驗組，每組10隻，陰性組給予0.9%氯化鈉溶液（20 ml/kg）灌胃，陽性組給予洛呱丁胺（4 mg/kg）灌胃，0.25 g/kg FS ext試驗組、0.50g/kg FS ext試驗組、1.00 g/kg FS ext試驗組分別給予0.25、0.50、1.00 g/kg FS ext。給藥30 min後，小鼠均給予蓖麻油0.4 ml灌胃，然後將每隻小鼠放入單獨的籠子中，地板襯有吸墨紙，將線網放置在離底部3 cm的籠中以使小鼠與吸墨紙隔開。觀察4 h內以下指標：初始半固體糞便時間，固體、半固體、液體糞便數量。采用腹瀉指數（EI）評估腹瀉的嚴重程度。EI=固體糞便數量×1+半固體糞便數量×2+液體糞便數量×3。

1.7.3 離體標本製備

選取健康家兔，實驗前禁食24 h，自由飲水。用木槌擊致頭昏，解剖家兔，以胃幽門與十二指腸交界處為起始部，取空腸並立即放入通有95%O2和5%CO2混合氣的台氏液中，將內容物衝洗幹淨並剪去腸係膜，剪成1.5～2.0 cm數段，一端用線結紮固定於通氣溝，另一端固定於張力換能器。給予前負荷1 g，浴槽內溫度維持在（37.0±0.5）℃，通氣溝以每秒1～2個氣泡的速度持續通入混合氣，待基線穩定後開始實驗。

1.7.4 FS ext對家兔離體空腸平滑肌自發性收縮的影響

待空腸平滑肌張力穩定後，單劑量加入FS ext(0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00 mg/ml，這些濃度是累加所得，即後一個的濃度由前一個濃度累加，主要目的是為了觀察家兔離體空腸平滑肌自發性收縮隨FS ext的濃度變化而變化的趨勢），以給藥前的張力為100%，記錄給藥後空腸平滑肌自發性收縮的張力變化。按照上述方法，用維拉帕米（0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00μmol/L）處理家兔離體空腸平滑肌作為對照，記錄給予維拉帕米後家兔離體空腸平滑肌自發性收縮的張力變化。

1.7.5 FS ext對由乙酰膽堿（ACh）和KCl誘導的家兔離體空腸平滑肌自發性收縮的影響

待空腸平滑肌張力穩定後，分別加入ACh(10μmol/L）和KCl(60mmol/L）預處理，出現最大波峰後，立即用台氏液衝洗腸管，等其穩定後，再次分別加入ACh(10μmol/L）和KCl(60μmol/L),15 min後，加入FS ext使其終濃度分別達0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00mg/ml，並記錄空腸平滑肌自發性收縮穩定時的張力變化。按照上述方法，用維拉帕米（0.001、0.010、0.100、1.000、3.000μmol/L）處理家兔離體空腸作為對照，重複上述步驟，並記錄此時空腸平滑肌自發性收縮穩定時的張力變化。

1.7.6 FS ext對由CaCl2誘導的家兔離體空腸平滑肌自發性收縮的影響

為確定FS ext對Ca2+內流的影響，首先讓腸管處於Tyrode溶液中，待其張力穩定後，將Tyrode溶液換為含EDTA的無Ca2+高K+溶液，持續30 min以從組織中除去Ca2+。再將溶液換為不含EDTA的無Ca2+高K+溶液，持續15 min，然後再加入FS ext(0.3、1.0 mg/ml），構建CaCl2(3×10-5～3×10-2 mol/L）的量-效曲線，觀察給予不同劑量FS ext後家兔離體空腸平滑肌自發性收縮率的變化。在加入維拉帕米（1μmol/L）的情況下，構建CaCl2(3×10-5～3×10-2 mol/L）的量-效關係曲線，觀察空腸平滑肌自發性收縮率變化。在沒有FS ext和維拉帕米預處理的情況下，將3×10-2 mol/L CaCl2誘導的家兔離體空腸平滑肌自發性收縮率認為是100%[12]。

1.8 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行數據分析，計量資料以表示，組間比較用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 植物化學分析

2.1.1 初步植物化學分析

對FS ext的初步植物化學分析表明其含有酚類、皂苷類和黃酮類化合物。

2.1.2 總黃酮的含量

FS ext中黃酮含量的測定表明，黃酮含量為8.13 mg/g。

2.1.3 高效液相色譜法檢測FS ext中的化學成分

采用高效液相色譜法對FS ext中的化學成分進行檢測，結果顯示，FS ext中主要含連翹苷和連翹酯苷A。在上述1.3.3的色譜條件下，連翹苷和連翹酯苷A的分離度良好，空白、混合標準品、樣品的色譜圖見圖1。

2.2 FS ext的急性毒性

在測量LD50的實驗過程中，小鼠按不同劑量的FS ext進行灌胃後，在觀察期內未出現任何死亡或毒性跡象。單次給予FS ext的劑量為16g/kg，小鼠在觀察期內未出現任何的死亡及行為變化。

2.3 FS ext對小鼠蓖麻油性腹瀉的影響

5組初始半固體糞便時間和EI比較，差異有統計學意義（P<0.05）。陽性組初始半固體糞便時間長於陰性組、0.25 g/kg FS ext試驗組、0.50 g/kg FS ext試驗組，差異有統計學意義（P<0.05);1.00 g/kg FS ext試驗組初始半固體糞便時間長於陰性組、0.25 g/kg FS ext試驗組，差異有統計學意義（P<0.05）。陰性組EI高於陽性組、1.00 g/kg FS ext試驗組，差異有統計學意義（P<0.05);0.25 g/kg FS ext試驗組、0.50 g/kg FS ext試驗組EI高於陽性組，差異有統計學意義（P<0.05，見表2）。

2.4 FS ext對家兔離體空腸平滑肌自發性收縮的影響

台氏液對家兔離體空腸平滑肌自發性收縮無明顯影響，差異無統計學意義（P>0.05，見圖2）。FS ext對家兔離體空腸平滑肌表現出劑量依賴性解痙作用，即半最大效應濃度（EC50)=1.21 mg/ml(1.11～1.26mg/ml,n=6），見圖3。圖形類似於維拉帕米（0.01～10μmol/L），其EC50為0.51μmol/L(0.42～0.59μmol/L,n=6），見圖4。

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