近年來，菌种结合酱香基酒基吡醬香型白酒以其獨特的强化嗪含感官風味和更為舒適的飲後體征感受，越來越受到消費者的工艺青睞。醬香型白酒的优化研究酒體中包含了種類更為豐富的風味物質和生物活性組分，如四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，提高TTMP），白酒近年來受到廣泛的中甲關注，被認為是菌种结合酱香基酒基吡與醬香風格密切相關的物質，同時也是强化嗪含行業中公認的“健康因子”，具有增加腦血管的工艺血流量，減少腦缺血性疾病的优化研究發作、改善學習的提高障礙、防止由無水乙醇引起的白酒胃粘膜損傷和腎中毒、防止由硫代乙酰胺引起的中甲急性肝中毒、降低腦萎縮的菌种结合酱香基酒基吡傷害、防止肝纖維化等功效、分解甘油三酯、改善高血糖、抑製α-葡萄糖苷酶活性，同時具有體外抗炎作用等諸多健康功效。
隨著“健康中國”發展戰略的製定和實施，消費者對於飲酒的態度越來越理性，對於白酒健康層麵的需求越來越強烈。由於醬香型白酒的獨特工藝特點，健康因子———四甲基吡嗪，仍然是研究的熱點。中國工程院孫寶國院士提出“白酒的發展方向是健康，健康白酒應該通過‘內尋外加，自然強化’來實現”。在實際釀酒生產過程中，從製曲、堆積或發酵階段篩選出高產四甲基吡嗪的微生物，並應用強化到特定的生產發酵階段，這種方式是常見的高產四甲基吡嗪的手段。王西等將從高溫大曲中篩選得到的產香枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）應用到醬香型白酒生產中，結果顯示堆積組發酵後的糟醅中四甲基吡嗪相對含量達到6.98 μg/g，是空白組的4.56倍；王曉丹等將篩選得到的一株地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）強化到粹沙工藝醬香白酒發酵的酒醅中，發酵後酒醅中的四甲基吡嗪含量是對照組的3.03倍。
以往的研究，僅應用菌種強化發酵的單一手段來提高基酒中的四甲基吡嗪含量。本研究針對醬香型白酒生產企業的實際生產工藝，對比了3種方法對醬香型白酒基酒中四甲基吡嗪的含量的影響，即利用菌種強化的方式，在釀酒發酵階段，通過功能微生物代謝提高基酒中四甲基吡嗪的含量；利用工藝優化方式，將菌劑加入尾酒中浸提得到高含量四甲基吡嗪的浸提液，在烤酒階段，通過蒸餾方式（浸提液加入地鍋串蒸）使四甲基吡嗪遷移入基酒中；應用菌種強化和工藝優化雙管齊下的方法。旨在為進一步提高醬香型白酒基酒中四甲基吡嗪的含量提供一種新的、可被企業實際應用的方法和思路。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
1.1.1 菌種和曲粉
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）M2（MBJ09001）：分離自茅台鎮某酒廠高溫大曲，保藏於中國普通微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏編號為CGMCC 18734。曲粉：貴州國台酒業五輪次釀酒生產時期的生產用曲粉。
1.1.2 試劑
小麥：某酒廠提供；四甲基吡嗪（色譜純）：上海麥克林生化科技有限公司；2-乙酰基吡啶（色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化鈉（分析純）：天津市匯杭化工科技有限公司；無水乙醇（分析純）：天津市康科德科技有限公司；甲酸（色譜純）：美國Fluka公司；甲醇（色譜純）：德國默克公司；蛋白腖、酵母浸粉、瓊脂粉（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；2-乙基丁酸（色譜純）：天津市光複精細化工研究所。
1.1.3 培養基
LB液體培養基：蛋白腖10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，調pH=7.5，121 ℃高壓滅菌20 min。LB固體培養基：在LB液體培養基中添加瓊脂粉 15 g。
1.2 儀器與設備
BPS-250HC高溫培養箱：上海申騁儀器科技有限公司；Q-Trap 5500三重四極杆液質聯用（high performance liquidchromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）儀：美國ABSCIEX公司；UFLC超高效液相係統：島津（上海）實驗器材有限公司；DGG-101-1BS電熱鼓風幹燥箱：天津市天宇實驗儀器有限公司；DK-S26電熱恒溫水浴鍋：上海森信實驗儀器有限公司；LMQ.C-80E立式滅菌器：山東新華醫療器械股份有限公司；IT-09A5磁力攪拌器：上海一恒科學儀器有限公司。
1.3 實驗方法
1.3.1 高產四甲基吡嗪菌劑的製備
菌種活化：從甘油管保存的枯草芽孢杆菌M2中挑取少許菌體，在LB固體培養基平板上劃線，37 ℃培養18 h，長出單菌落後挑取單菌落再次劃線，以此重複三次，對菌株進行活化和純化。一級種子液：從活化後的枯草芽孢杆菌M2平板挑取少許單菌落菌體接種於LB液體培養基，裝液量15 mL/150 mL，37 ℃、200 r/min條件下培養至生長穩定期。二級種子液：將一級種子液按10%（V/V）的接種量接於LB液體培養基，裝液量150 mL/250 mL，37 ℃、200 r/min條件下培養至生長穩定期。固體菌劑製備：稱取麥沙（從酒廠製曲車間取得，與實際製曲生產時粉碎度相同的磨碎的小麥，已加水，但未添加母曲）和麥粉（用粉碎機粉碎的小麥粉），裝入不鏽鋼盆中，每個不鏽鋼盆中麥粉和麥沙按質量比1∶1混勻。每盆3 kg原料中加入300 mL二級種子液（接種量為10%）和750 mL水，最終水分含量為37.1%。不鏽鋼盆上覆蓋紗布，放入高溫培養箱中進行固體培養。培養期間，第1天在培養箱中37 ℃培養24 h；第2天將培養溫度調整至44 ℃，持續1 d；發酵第3天將培養溫度調整至52 ℃，高溫生香保持2 d；以此條件循環兩次製備得到固體菌劑。發酵過程中觀察發酵情況，每天根據濕度補水、攪拌、測量溫度。
1.3.2 高產四甲基吡嗪菌劑的生產應用方式
菌種強化方式：將製備得到的菌劑自然幹燥後再進行磨粉，應用於2019年貴州國台酒業五輪次基酒的生產中，選取了三車間9班8號窖池作為實驗窖池，另選擇該班組其他4個窖池作為對照窖池。應用功能枯草芽孢杆菌M2製作的固態菌劑（幹燥粉碎後）（共10 kg）強化到醬香型白酒堆積發酵結束後、入窖發酵之前窖池的上層糟醅中，菌劑與普通曲粉的質量比為1∶5，跟蹤發酵生產進程，經過一個輪次的發酵後（30 d），開窖烤取基酒，評定基酒中四甲基吡嗪的含量和感官質量的差異。
工藝優化方式：將製備得到的高含量四甲基吡嗪的菌劑，按照1∶10的質量比添加到醬香型白酒基酒生產過程產生的頭尾酒中，浸泡7 d，獲得頭尾酒浸提液，再將頭尾酒浸提液替代普通頭尾酒，倒回地鍋，通過蒸餾烤酒使得浸提液中的四甲基吡嗪遷移至基酒中，評定基酒中四甲基吡嗪的含量和感官質量的差異。
菌種強化結合工藝優化方式：應用上述菌種強化和工藝優化相結合的方式，即在釀酒生產階段進行菌種強化，在蒸餾烤酒階段進行工藝優化。在2019年貴州國台酒業六輪次基酒的生產過程中，選取了一車間1班6號窖池作為實驗窖池，該班組其他窖池均為對照窖池。評定基酒中四甲吡嗪的含量和感官質量的差異。
1.3.3 分析檢測方法
（1）四甲基吡嗪的檢測方法曲粉/菌劑樣品前處理：稱取2.8 g粉碎後的曲粉/菌劑樣品，加入20 mL體積分數為53%的乙醇溶液，浸泡10 min，25 ℃條件下超聲提取30 min，超聲功率250 W，超聲頻率40 kHz，20 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液，稀釋至合適倍數後過0.45 μm的有機濾膜，取過濾後樣品1 mL於液相樣品瓶中，供液質分析。基酒酒樣前處理：基酒酒樣稀釋至合適倍數後0.45μm的有機濾膜，取過濾後樣品1 mL於液相樣品瓶中，供液質分析。
采用HPLC-MS檢測四甲基吡嗪含量，參考以往文獻報道的方法進行優化[18-21]，液相色譜條件ACQUITY UPLCBEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫35 ℃；流動相為甲醇：0.1%甲酸=35∶65（V/V）；流速0.4 mL/min；洗脫梯度：0.01～1 min，10%甲醇；1～5 min，35%甲醇。質譜條件：多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，具體參數見表1。
正離子模式下，以四甲基吡嗪標準品的保留時間、精確質量數匹配，結合二級特征碎片離子，實現定性分析。采用外標法進行四甲基吡嗪的定量分析。
（2）理化指標檢測方法菌劑和大曲的酸度測定采用酸堿滴定法，糖化力采用菲林滴定法，具體檢測方法參見《白酒生產技術全書》。
（3）基酒感官品評方法組織4位國家一級品酒師，對本研究中的基酒樣品進行感官品評，分別從曲香、醬香、酒體醇和度、後味、幹淨度這5個維度進行打分評價（0～9分，0代表感知不到，9代表特征極為明顯）。
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