時間分辨熒光免疫分析技術(time-resolvedfluoroimmunoassay,时间TRFIA)是依賴於稀土元素獨特的熒光性質而發展起來的一種免疫檢測技術，它集合了放射免疫技術、分辨分析酶聯免疫技術以及普通熒光免疫技術的荧光应用優點，具有靈敏度高、免疫特異性強、进展穩定性好，时间且線性範圍寬，分辨分析熒光壽命長，荧光应用操作簡單和非放射性等特點，免疫在免疫分析領域展現了良好的进展應用前景。圍繞時間分辨熒光在免疫分析中的时间最新研究進展，介紹了幾種常見的分辨分析用於TRFIA的材料，闡述了TRFIA在免疫診斷、荧光应用食品檢測、免疫環境監測等方麵的进展應用，並對其發展方向和應用前景進行了展望。
時間分辨熒光免疫分析技術(time-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA)是將時間分辨熒光與免疫分析技術相結合，依賴於稀土元素熒光壽命長、Stokes位移大、發射光譜信號峰尖銳等獨特的熒光性質而發展起來的一種檢測技術，其基本過程是首先利用稀土元素標記抗原或抗體，在一定的體係中與待測物反應形成免疫複合物；然後通過設定適當的延遲時間和門控時間，脈衝激發待測產物，短壽命的背景熒光信號(納秒級別內)會在延遲時間內衰減消失，再對熒光信號進行采集，得到長熒光壽命的信號信息；最後根據相對熒光強度對待測物進行定量分析。該方法能夠消除本底短壽命熒光的幹擾，提高了檢測信噪比，與傳統的熒光檢測技術相比，明顯提高了熒光檢測結果的靈敏度和準確度。
研究從TRFIA的材料和應用兩個方麵對其進行闡述，列舉了幾種常見的用於TRFIA的材料及其製備方法的改進，並且對TRFIA在免疫診斷、食品檢測、環境監測等領域的應用進行了介紹。
稀土離子本身的發光效率較低，引入適當的有機配體與稀土離子配位，利用分子內的能量轉移，敏化中心離子發光，可以有效增強稀土離子的熒光性質。選擇合適的功能基團和設計適當的配體，使得稀土元素與抗原抗體形成穩定的熒光複合物，可以用於時間分辨熒光免疫分析。常用的稀土螯合劑主要包括多氨基羧酸類、β-二酮類、菲囉啉類、水楊酸類以及聯吡啶類螯合劑。
多氨基羧酸類螯合劑包括乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙三胺四乙酸(DTTA)和二乙三胺五乙酸(DTPA),主要用於解離-增強鑭係熒光免疫分析係統(DELFIA)。此類螯合劑與稀土離子螯合的能力很強，具有穩定性好、在酸性增強液中稀土離子解離快的優點，這樣有利於提高分析方法的靈敏度。
β-二酮類螯合劑包括β-NTA、2-噻吩甲酰基三氟丙酮(TTA)和三甲基乙酰三氟丙酮(PTA),它們能與稀土離子形成熒光很強的配合物，但是這些二齒配位體上沒有可與抗原(抗體)結合的功能性取代基，並且形成的配合物穩定性較差，不能直接作為標記物進行時間分辨熒光分析。因此，有課題組設計合成一種氯磺酰化的四齒β-二酮，用作稀土離子螯合劑。
此外，4,7-二(氯磺酰基苯基)-1,10-菲囉啉-2,9-二羧酸(BCPDA)是典型的菲囉啉衍生物，主要用於CyberFluoro體係，它的特點是可以與Eu3+配位發出長壽命的熒光，無需加入熒光增強溶液便可直接測定熒光強度，但是BCPDA-Eu3+在時間分辨熒光免疫分析中存在靈敏度較低的缺點，通過引入生物素-鏈黴親和素係統(BAS),使得檢測靈敏度得到顯著提高。
隨著納米材料和納米技術在醫學、生物傳感、環境科學等領域的迅速發展，稀土離子摻雜的納米顆粒作為一種光致發光納米材料，以其獨特的熒光性能引起了人們的普遍關注。稀土摻雜的納米晶體在熒光性能優越和熒光壽命長的基礎上，具有量子產率高、結構穩定等優點，代替稀土螯合物材料成為新一代熒光納米探針。
目前，用於製備稀土摻雜納米顆粒的方法主要包括水(溶劑)熱合成法、熱分解法、共沉澱法等。絕大部分方法是在親油性表麵活性劑以及其它高沸點的有機溶劑中製備稀土摻雜納米顆粒的，這將有利於合成尺寸分布範圍窄、結晶程度好、核殼結構明確、光學性能優異的高質量納米顆粒，但該種材料疏水性，不易與生物體係相容。為了使其適用於生物醫學領域，需要對納米粒子進行表麵修飾和功能化，增加疏水性稀土摻雜納米顆粒的親水性。
研究表明，通過二氧化矽包覆、配體交換、配體氧化、配體吸引、層層自組裝以及配體剝離等幾種表麵修飾方法，如圖2所示，可以製備具有良好生物相容性的親水性納米材料，從而進一步拓寬TRFIA的應用領域。
量子點(quantumdots,QDs)是一種尺寸約為1～10nm的光致發光半導體納米晶體，具有激發光譜寬且連續分布、發射光譜窄而對稱、斯托克斯位移較大、光化學穩定性高、熒光壽命長等優越的熒光特性，是一種理想的熒光探針。Chen等開發了一種基於熒光共振能量轉移(FRET)的均相時間分辨熒光免疫分析定量檢測癌胚抗原(CEA)的方法，將成功製備的鋱螯合物和穀胱甘肽修飾的硒化鎘/硫化鋅(CdSe/ZnS)量子點分別與不同的抗CEA單克隆抗體(McAb)結合，在雙抗體夾心模式下，利用時間分辨熒光檢測儀在量子點發射峰(565nm)外檢測到與CEA濃度成正比的熒光強度，並與CEA濃度成正比。該方法操作簡便、耗時較短、靈敏度高，製備的水溶性量子點的光學性質適合於均相免疫分析，作為一種熒光材料，可以進一步應用於臨床檢測。
含稀土配合物的熒光聚合物微球結合微球的比表麵積大、表麵易功能化優點和稀土配合物極寬的斯托克斯位移和超長熒光壽命(約0.5ms)的特性，在時間分辨熒光分析方麵也得到了很好的應用。
免疫診斷是應用免疫學的理論、技術和方法診斷各種疾病以及測定免疫狀態，常用技術包括放射免疫、酶聯免疫、化學發光等。TRFIA憑借其靈敏度高、特異性強、簡便、快速的優點，廣泛應用於傳染病診斷、腫瘤標誌物檢測以及其它臨床疾病的診斷(表1)。
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